L'agonista alfa-2 adrenergico guanfacina aumenta l'attività del trasportatore per la creatina in fibroblasti cutanei umani.

Abstract

I risultati presentati in questo lavoro di tesi riguardano un’attività di ricerca rivolta a studiare la possibile modulazione farmacologica del trasportatore della creatina in cellule neuronali. Lo scopo è quello di migliorare la funzione e suggerire delle strategie terapeutiche in patologie legate ad un’insufficiente incorporazione di creatina nei neuroni. Tra le patologie, la più diffusa è la sindrome da carenza di creatina, dovuta ad una mutazione nel suo trasportatore o in quello del precursore GAA (acido guanidinoacetico), associate a forme di ritardo mentale. I trasportatori per la creatina sono espressi in altri tipi di cellule tra cui i fibroblasti cutanei umani, che rappresentano quindi modelli cellulari ampiamente utilizzati in vitro e nella nostra ricerca. Mediante l’utilizzo di una tecnica colorimetrica-enzimatica abbiamo misurato la concentrazione intracellulare di creatina in condizioni basali, e in seguito a somministrazione esogena della stessa. Utilizzando questo modello, abbiamo valutato la capacità del farmaco guanfacina (agonista alfa 2 adrenergico) di aumentare l’incorporazione della creatina migliorando l’efficienza del trasportatore. L’aggiunta di creatina esogena ha determinato un aumento concentrazione-dipendente della stessa nel citoplasma; tale aumento è stato inibito dall’ acido β-guanidinopropionico (β-GPA). L’effetto del GPA suggerisce che l’incorporazione di creatina sia dipendente dal trasportatore poiché le due molecole possiedono analogia strutturale e competono per il trasporto. L’effetto di stimolazione della guanfacina dipende dall’azione del trasportatore. La ricerca ha coinvolto anche ricercatori di elettrofisiologia afferenti al DIBRIS, che studiano la capacità della creatina di evocare risposte elettriche di neuroni coltivati su matrici di microelettrodi ed un eventuale azione della guanfacina. La ricerca per cui sono stati presentati i dati è stata svolta presso il Laboratorio della sezione di Farmacologia del DIMI.

The results of this thesis are part of a research project aimed at studying the possible pharmacological modulation of creatine transporter in neurons. The overall aim of the research is to identify potential therapeutic strategies for treating neurological and neuropsychiatric disorders characterized by a deficiency of creatine or its precursor guanidinoacetic acid (GAA) due to mutations in their respective transporters. These deficiencies lead to reduced creatine concentrations in neurons and are associated with brain developmental abnormalities. The creatine transporter is also expressed in other cell types such as human skin fibroblasts. These cells are therefore widely used as in vitro models to study the activity of the neuronal creatine transporter and have been employed in this study. Using a colorimetric-enzymatic technique, we measured intracellular creatine concentration under basal conditions and after exogenous creatine administration. Through this model, we evaluated the capacity of guanfacine, an alpha-2 adrenergic agonist, to enhance creatine uptake by increasing transporter efficiency. Treatment of fibroblasts with increasing concentrations of creatine led to a concentration-dependent increase in intracellular creatine levels, which was inhibited by β-guanidinopropionic acid (β-GPA). The effect of β-GPA suggests that creatine uptake is transporter-dependent, as the two molecules share structural similarities and compete for the same transporter. The stimulatory effect of guanfacine is mediated through the creatine transporter. The study was conducted in collaboration with electrophysiology researchers from the DIBRIS, who are investigating the ability of creatine to elicit electrical responses in neurons cultured on microelectrodes arrays, and the possible effects of guanfacine in this context. The research was conducted at the Laboratory of the Pharmacology Section of the DIMI.