Caratterizzazione delle vescicole extracellulari e del loro profilo di espressione dei microRNA nel midollo osseo di pazienti con neuroblastoma ad alto rischio

Abstract

Il neuroblastoma (NB) è il tumore solido extracranico più comune nei bambini sotto i 5 anni e nasce da cellule della cresta neurale nel sistema nervoso simpatico. I pazienti vengono classificati in quattro categorie di rischio: molto basso, basso, intermedio e alto (HR). Il midollo osseo (BM) è il principale sito metastatico. Le biopsie liquide sono sempre più utilizzate nei pazienti HR, e sia BM che sangue periferico sono fonti promettenti di vescicole extracellulari (EV). Lo studio ha analizzato pazienti italiani ad alto rischio, con e senza infiltrazione midollare. Le EV sono state caratterizzate per dimensioni tramite microscopia elettronica, Zetasizer e nanoparticle tracking. Il contenuto di microRNA è stato quantificati con Qubit, valutato con Agilent Bioanalyzer e analizzato con RNA-seq e studio dell’espressione differenziale. I target dei microRNA sono stati esplorati con tool online e approfonditi tramite letteratura scientifica. I risultati sono stati poi validati con PCR digitale ad alta sensibilità. È il primo studio che descrive le EV isolate dal BM nei pazienti NB. Nonostante l’esiguo volume iniziale (500 µl di plasma) e la complessità del campione, la tecnica si è dimostrata efficace. Nei pazienti con infiltrazione midollare, l’espressione dei miRNA è risultata generalmente ridotta. In particolare, la downregolazione dei miRNA coinvolti nella modulazione di PD-L1 suggerisce un ruolo delle EV nella regolazione immunitaria a livello delle metastasi ossee. I dati preliminari ottenuti con PCR digitale confermano quelli del sequenziamento.

Neuroblastoma (NB) is the most frequent extra-cranial solid tumor in children younger than 5 years. It is a sympathetic nervous system cancer originating from neural crest-derived cells. According to the International Neuroblastoma Risk Group classification system, patients are stratified into four risk categories: very low, low, intermediate, and high risk (HR). The main metastatic niche in NB patients is the bone marrow (BM). Liquid biopsy analysis is an emerging technique in the study and diagnosis of HR patients: BM and peripheral blood represent an appealing source of extracellular vesicles (EVs). The study cohort included Italian high-risk NB patients with and without BM infiltration. Morphological analyses focused on EV size, investigated using transmission electron microscopy, Zetasizer analysis and nanoparticle tracking analysis. MicroRNA content was quantified with Qubit, qualitatively assessed by Agilent Bioanalyzer, and subsequently analyzed through RNA sequencing and differential expression analysis. MicroRNA targets were investigated using online tools for preliminary analysis and then further explored in-depth through research in literature. Validation of the results was performed using a high-sensitivity digital PCR. This is the first study characterizing EVs isolated from the BM of NB patients. Data demonstrated the implementation of an efficient technique for isolating EVs despite the small starting volume as low as 500 µl of plasma and the complexity of a biological sample as BM. The results highlighted that miRNA expression was generally downregulated in BM-infiltrated patients. Specifically, the downregulation of miRNAs altering the expression of the immune checkpoint ligand PD-L1 supports the involvement of sEVs in regulating the immunomodulatory microenvironment at the level of BM metastasis. Preliminary results obtained with a newly implemented protocol for EV-miRNA expression by digital PCR showed consistence with our RNA-sequencing data