Set up di procedure per l'identificazione sul campo di insetti di interesse forense e sanitario

Abstract

In ambito forense e sanitario, è importante identificare correttamente i reperti entomologici, in particolare le larve di ditteri, poiché forniscono informazioni preziose per le indagini forensi. Per identificare gli insetti si utilizza comunemente un approccio morfologico, ma in altri casi, come gli stadi immaturi, è spesso necessario integrare con un'analisi molecolare, in quanto non sempre sono presenti delle chiavi dicotomiche complete. Inoltre, nel caso di campioni degradati o frammenti di esemplari privi di caratteristiche diagnostiche è necessario ricorrere alle tecniche molecolari. In questo progetto di tesi, è stato utilizzato un nuovo strumento piccolo e portatile, il MinION, per eseguire il sequenziamento nanopore; in particolare, abbiamo messo a punto un protocollo per identificare le larve sul campo. Tutto il DNA è stato estratto utilizzando il protocollo TRIzolTM e, dopo il sequenziamento con il dispositivo, le sequenze ottenute sono state inserite nel software BLAST per essere identificate. Questo studio non ha portato a risultati significativi, in quanto sono state trovate sequenze di DNA contaminanti, derivanti dall’ambiente in cui le larve sono state allevate. Le larve sono state invece identificate tramite chiavi entomologiche. Ciò indica che è ancora essenziale utilizzare l'approccio morfologico per l'identificazione e che è necessario modificare questo protocollo, concentrandosi sull'analisi di geni mitocondriali e nucleari specifici per le specie di Ditteri. Nonostante tutto, è stato dimostrato che questo nuovo tipo di tecnologia può essere utile sul campo, in quanto i costi e i tempi necessari per condurre l'analisi sono notevolmente ridotti.

In the forensic and sanitary field, it is important to correctly identify entomological findings, especially Diptera larvae, as they provide valuable information for the forensic investigations. A morphological approach is commonly used to identify insects, but in other cases, like immature stages, it is often necessary to integrate with a molecular analysis, as complete dichotomous keys are not always available. Furthermore, in the case of degraded samples or fragments of specimens lacking diagnostic features, it is necessary to appeal to molecular techniques. In this thesis project, a new small and portable instrument, the MinION, was used to perform nanopore sequencing; specifically, we set up a protocol for identifying larvae on field. All the DNA was extracted using the TRIzolTM protocol and after sequencing with the nanopore device, the obtained sequences were inserted into BLAST software in order to be identified. This study did not lead to any significant results as contaminating DNA sequences were found; they probably derived from the environment where the larvae were bred. Instead, the larvae were identified by entomological keys. This indicates that it is still essential to use the morphological approach for identification and that it is necessary to edit this protocol, by focusing on the analysis of the mitochondrial and nuclear genes specific for Diptera species. Despite all, it has been shown that this new type of technology can be useful on field, as the costs and the required time to conduct the analysis are greatly reduced.