Completamento delle sequenze all'estremità 5' dei geni del collagene fibrillare nella spugna di mare Chondrosia reniformis mediante approccio GeneRacer

Abstract

Chondrosia reniformis è una spugna marina dei bassi fondali che si trova prevalentemente nel Mar Mediterraneo. La sua matrice extracellulare è caratteristica perché ricchissima di collagene. Della spugna sono stati sequenziati il trascrittoma e il genoma ma non è presente la parte iniziale della trascrizione, il promotore. Quindi lo scopo è quello di conoscere la sequenza di inizio della trascrizione. Sono necessari diversi passaggi, dove però il processo principale è considerato quello della RACE 5’, Rapid Amplification of cDNA Ends, un metodo di amplificazione genica che si concentra sull’estremità 5’. Il primo passo da fare è isolare l’RNA di studio, per poi compiere la defosforilazione degli mRNA, meccanismo che scarta in automatico gli mRNA incompleti e i non-mRNA. Il reagente fondamentale è CIP, fosfatasi intestinale di vitello. Segue poi l’eliminazione del cappuccio 5’ con l’utilizzo di TAP, pirofosfatasi acida del tabacco, e il legame tra l’oligoRNA e l’RNA decappato. Viene svolta la retro-trascrizione per produrre il cDNA, che verrà utilizzato per l’amplificazione dell’estremità 5’ tramite PCR, per la quale sono necessari dei primer specifici che vengono progettati. Il prodotto PCR viene integrato nel vettore pCR 4-TOPO, plasmide impiantato in cellule competenti di E.Coli per svolgere la clonazione. Il plasmide in seguito viene isolato e purificato per procedere poi con il riconoscimento delle sequenze di interesse. L’obbiettivo è quello di conoscere le sequenze complete che codificano per le fibre di collagene in modo tale da poterle poi utilizzare per scopi biotecnologici.

Chondrosia reniformis is a low-lying marine sponge found mainly in the Mediterranean Sea. Its extracellular matrix is characteristic because it is very rich in collagen. The transcriptome and genome of the sponge have been sequenced but the initial part of the transcription, the promoter, is not present. So the aim is to know the sequence of transcription start. Several steps are required, but the main process is considered to be RACE 5', Rapid Amplification of cDNA Ends, a gene amplification method that focuses on the 5' end. The first step is to isolate the target RNA, and then dephosphorylate the mRNA, a mechanism that automatically discards incomplete mRNAs and non-mRNAs. The fundamental reagent is CIP, calf intestinal phosphatase. Then the removal of the 5' cap with the use of TAP, acid tobacco pyrophosphatase, and the link between oligoRNA and decapitated RNA. The back-transcription is carried out to produce the cDNA, which will be used for amplification of the 5' end via PCR, for which specific primers are needed and designed. The PCR product is integrated into the pCR 4-TOPO vector, a plasmid implanted in competent E.Coli cells to perform cloning. The plasmid is then isolated and purified to proceed with the recognition of sequences of interest. The aim is to know the complete sequences coding for collagen fibres so that they can be used for biotechnology purposes.